目前已有超過 40% 獲得市場批準的單克隆抗體在其配方中添加了組氨酸和鹽酸組氨酸，在基于蛋白質(zhì)的生物制劑配方中，常用的組氨酸濃度范圍為10 mM~20 mM，已知的最低使用濃度為3 mM（bamlanivimab，pH 6.0），最高使用濃度可達50 mM（Takhzyro?，pH 6.0，Entyvio?，pH 6.3）[1]。

組氨酸的結(jié)構(gòu)可分為三個主要部分（見圖1）：α-羧基（pKa 1.8）、α-氨基（pKa 9.2）和咪唑側(cè)鏈（pKa 6.0）。咪唑基團是一種很強的親核基團，能夠快速提供與接受質(zhì)子，在中性環(huán)境中，組氨酸不帶電，表現(xiàn)出疏水特性，而當pH< pKa 時，組氨酸質(zhì)子化帶正電，轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性分子。

在基于蛋白質(zhì)的生物制劑中，組氨酸通常起到pH調(diào)節(jié)劑、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、抗氧化劑、降粘劑及增溶劑的作用：

溶液pH會通過改變氨基酸側(cè)鏈的電荷狀態(tài)、破壞或形成非共價相互作用、甚至引發(fā)共價修飾等方式對氨基酸殘基的化學(xué)完整性以及蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的折疊等多種性質(zhì)產(chǎn)生深遠影響，緩沖液可用于控制溶液的 pH值。為了獲得更好的緩沖效果，緩沖液的pH值應(yīng)控制在緩沖劑 pKa 值的1個pH單位范圍內(nèi)。組氨酸的 pKa 約為 6.0，能夠使組氨酸緩沖液的pH值保持在5.5至6.5之間。然而，由于配方中存在其他輔料，組氨酸實際的緩沖范圍更更寬（pH 5.0 ~6.9）。在實際生產(chǎn)過程中，組氨酸常與鹽酸組氨酸共同發(fā)揮作用，如表1所示，部分獲批抗體制劑配方中，組氨酸與鹽酸組氨酸總是成對出現(xiàn)。

組氨酸還可以直接作為多種基于蛋白質(zhì)的生物制劑配方的良好穩(wěn)定劑。蛋白質(zhì)的物理穩(wěn)定性包括構(gòu)象穩(wěn)定性、膠體穩(wěn)定性和界面穩(wěn)定性。輔料的添加通常會對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生不止一種影響。與其他緩沖劑相比，組氨酸有助于提高構(gòu)象穩(wěn)定性和膠體穩(wěn)定性，維系構(gòu)象穩(wěn)定性的主要機制為配體結(jié)合。如圖2所示，在濃度、pH值和離子強度完全相同的情況下，組氨酸對干擾素τ制劑的構(gòu)象穩(wěn)定作用優(yōu)于其他緩沖液（如磷酸鹽和Tris）[2]。

膠體穩(wěn)定性涉及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，其中蛋白質(zhì)作為典型的膠體，分子間產(chǎn)生凈吸引力或排斥力，因此，膠體穩(wěn)定性影響蛋白質(zhì)聚集的傾向。研究表明，組氨酸穩(wěn)定性的機制與緩沖液分子遮蔽蛋白質(zhì)表面暴露于溶劑中的疏水區(qū)域有關(guān)。

此外，組氨酸能通過與其他殘基形成氫鍵，阻止抗體鉸鏈區(qū)的裂解，在相同的pH 值和離子強度條件下，與磷酸鹽相比，使用組氨酸作為緩沖劑時，鉸鏈區(qū)的水解速率更低。

在某些情況下，液體制劑不夠穩(wěn)定，將蛋白質(zhì)制成固態(tài)制劑是延長不穩(wěn)定治療性蛋白質(zhì)保質(zhì)期的一種替代方法。然而，在固態(tài)制劑的生產(chǎn)過程中，冷凍和干燥階段產(chǎn)生的壓力極易導(dǎo)致蛋白質(zhì)受損，組氨酸在此過程中則可對蛋白質(zhì)起到保護作用。因此，組氨酸是蛋白制劑凍干過程中使用最廣泛的氨基酸，其通過形成玻璃狀基質(zhì)，將蛋白質(zhì)分子分隔開，并限制蛋白質(zhì)遷移，從而抑制蛋白質(zhì)聚集和變性。

組氨酸還是一種抗氧化劑，能夠清除溶液中的羥基自由基和單線態(tài)氧。微量金屬離子，如銅和鐵，通常以雜質(zhì)的形式存在于藥物制劑中，并能促進蛋白質(zhì)的氧化。在蛋白質(zhì)產(chǎn)品的加工和儲存過程中，容器（例如不銹鋼制造設(shè)備）也可能滲出具有氧化活性的金屬。由于組氨酸能與這些離子形成強復(fù)合物，因此可作為抗氧化劑使用。將組氨酸用作輔料而也能為提高體內(nèi)抗氧化保護提供一種安全有效的方法。

鑒于皮下注射的注射量有限（小于2 mL）以及劑量要求較高（幾百毫克或更多），單克隆抗體有時會以較高濃度配制[3]。FDA批準的單克隆抗體制劑中，有三分之一是高蛋白濃度配制的（100 mg/mL或更高）。在這些獲批的單克隆抗體中，最高蛋白濃度為200 mg/mL。由于膠體蛋白溶液中的蛋白質(zhì)相互作用，單克隆抗體在高濃度制劑中表現(xiàn)出復(fù)雜的溶液特性，如高粘度、高聚集傾向和低穩(wěn)定性。這些特性嚴重阻礙了用于皮下注射的高濃度單克隆抗體溶液的開發(fā)。此外，生物制藥的高粘度使得制劑的最終超濾或透析步驟變的困難。

組氨酸已被證明可通過陽離子-π或π-π堆積相互作用與芳香族殘基相互作用，并有助于降低粘度。當組氨酸作為不同濃度和不同pH值下的輔料使用時，mAb之間的分子間相互作用的大小和水動力學(xué)半徑會受到影響。隨著組氨酸濃度的增加，制劑的水動力學(xué)半徑增大，在組氨酸濃度約為20 mM時達到峰值。組氨酸對水動力學(xué)半徑的影響與溶液粘度和滲透壓的變化有關(guān)。這些變化可能是氫鍵、芳香族（例如π堆積）和靜電相互作用的結(jié)果。例如，在150 mg/mL的全人源ABX-IL8中，40 mM組氨酸可使粘度減半。因此，在弱酸性條件下，添加組氨酸是降低高濃度蛋白質(zhì)溶液粘度的良好選擇，組氨酸鹽酸鹽則是降低高濃度蛋白制劑粘度的首選鹽。

溶解度不足是藥物開發(fā)過程中常見的瓶頸，研究表明組氨酸可提高大豆蛋白的溶解度。大豆蛋白是一種常用的活性成分。無論鹽濃度如何，加入組氨酸都能提高大豆蛋白的溶解度并降低其濁度（圖3）[4]。

除卻以上作為生物制劑配方中的組分之外，組氨酸還可用于色譜法純化和分析單克隆抗體的洗脫液，在洗脫緩沖液中添加組氨酸可以提高單克隆抗體（mAbs）色譜純化的雜質(zhì)清除率。

參考文獻：

[1] Robert G. Strickleya,, William J. Lambertb, A review of formulations of commercially available antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences.2021,2590-2608

[2] Katayama, et al. Effect of Buffer Species on the Thermally Induced Aggregation of Interferon-tau, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2006,95,6

[3] Shawn Shouye Wang,, Yifei (Susie) Yan and Kin Ho, US FDA-approved therapeutic antibodies with high-concentration formulation: summaries and perspectives，Antibody Therapeutics, 2021, 4, 262–273

[4] Wang, Y., Ma, T., Liu, C., Guo, F., Zhao, J. L-Histidine improves solubility and emulsifying properties of soy proteins under various ionic strengths. LWT ,2021,152, 112382.

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